蛋白電泳測量運用計算機掃描法

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本文作者：林林、何廣源 單位：曾廣東省順德中醫院檢驗科

1材料與方法

1．1標本來源

取自陸軍總醫院檢驗科常規檢查健康人血清30份。

1．2儀器與試劑

電泳儀1套；計算機（帶有Windows操作系統和安裝Adopephotoshop及Excel等軟件）1臺，掃描儀1臺（光學分辨率在1000dpi，吸光度2．8以上）醋酸纖維薄膜等。巴比妥緩沖液（pH8．6離子強度為0．06mol／L）；配置好后用1mol／L氫氧化鈉（NaOH）溶液調節pH值至8．6。染色液：0．1％氨基黑10B，漂洗液：取蒸餾水800mL、甲醇50mL及冰醋酸150mL混合而成。透明液：石蠟油透明液。

1．3操作

參照《全國臨床檢驗操作規程》蛋白電泳操作方法［1］，對點樣和透明掃描幾個步驟加以改進。

1．3．1自行制備點樣器

（1）常規分析（剪切后用NaOH浸泡洗脫比色法）：先用砂輪將蓋玻片打磨平滑，再用兩塊載玻片夾住蓋玻片，露出1cm，用透明膠紙綁緊就成了一個很好的加樣器了。（2）掃描法：把蓋玻片截掉一半，用同樣的方法綁緊?；蛘呒羧?cm×1cm的濾紙條，加樣效果也不錯。

1．3．2透明

將脫色吹干后的薄膜浸入透明液中，約10min薄膜完全透明，然后將膜條置于潔凈、干燥的玻璃板或透明膠片上［2－3］。

1．3．3掃描

用高分辨率掃描儀透射掃描薄膜［4］，分別對血清中清蛋白（ALB）及α1、α2、β、γ球蛋白5種成分進行掃描分析。掃描條件為500dpi，保存為RBG模式tiff文件。

1．3．4應用

Adopephotoshop軟件，將每個圖像分10×100個區間，并用ImageTool圖像分析軟件分析信息參數分別記錄各區間的C、N、Y、K、∑、R、L、a、b等圖像色譜參數數據，將上述參數導入Excel電子表格中，運用Excel的引入函數，插入圖表，識別低段等功能，可以畫出蛋白質組分分布曲線，百分含量。

1．4方法學評價

采用配對數據t檢驗，以陸軍總醫院Sebia全自動蛋白電泳分析儀為參照，分別比較掃描法和常規法與Sebia蛋白電泳儀檢測結果之間的差異，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

掃描法和常規法與Sebia蛋白電泳儀檢測結果之間的差異分別見表1、2。實驗結果表明，掃描分析測定法與Sebia蛋白電泳儀檢測結果不存在差異，以Sebia全自動蛋白電泳儀檢測結果為參照，掃描分析測定法在方法學上，可以接受，各項t值均小于常規法，而且在操作上省去了剪切、洗脫、比色等煩瑣工夫，避免因此而帶來的誤差。

3討論

3．1本實驗方法在電泳的前期操作與改良的常規方法一樣［5］，后期的檢測法是根據電泳圖譜的色深（吸光度值）直接反映了該區帶蛋白質的含量，透明膠片的色深與數字化圖譜的RBG信息參數呈反相關，與油墨量∑和L（灰度）呈正比（用油墨量∑為參數的分析結果與Sebia結果最為符合）。由于蛋白分析是測其相對含量，通過分析其色譜參數可計算出蛋白各組分的相對含量百分比。采用了計算機Adopephotoshop應用軟件和ImageTool圖像分析軟件（試用版）以及Excel電子表格統計軟件分析系統，但現在幾種軟件中的綜合使用會帶來工作量的增加，分析時間較長，離實際應用還有一段距離，這要求檢驗人員必須與軟件專業人員一起自行研究編寫一種應用。軟件該軟件能直接將圖像色譜信息參數記錄下來，并用相應的計算分析軟件（可以是Excel，也可以是其他數據分析軟件）分析圖像色譜參數，從而計算出蛋白質各組分的百分含量，真正做到圖像處理、分析、計算一體，其經濟效益和社會效益是非常有前景的。

3．2蛋白電泳的分離效果直接影響到分析結果的準確性和穩定性，因此往后研究工作的重點在提高電泳的分離質量［6］?？偨Y起來，主要有如下幾方面：（1）是電泳支持物的選擇上，可以比較瓊脂糖凝膠與醋纖維膜的分離效果和穩定性。（2）是加樣的方法上可以借鑒全自動蛋白電泳儀的加樣裝置，選擇質地均勻、吸水性能好、蛋白質電滲作用小的濾紙，當然還要考慮硬度和厚度等因素，可制成一排多個標本的加樣器。（3）是可購買較高配置的電泳儀，使電泳電流、電壓穩定，增大可調電壓范圍。